Durant sa jeunesse, il réside à Paris. Il devient avocat au Parlement, en 1549, après avoir achevé ses études sous la direction de Jacques Cujas.

Durant les guerres de Religion, désireux de participer à la réconciliation entre protestants et catholiques, il s’attache à chercher les origines historiques de l’unité de la nation française jusque dans le passé préchrétien du pays. Mettant à profit une longue convalescence après un empoisonnement accidentel survenu en 1558, il commence à travailler sur ce sujet jusqu’en 1560, année où il publie le premier tome de ses Recherches de la France.

En 1565, il s’illustre en tant que partisan du gallicanisme par sa plaidoirie dans le procès qui oppose l’Université de Paris aux Jésuites, faisant triompher la cause de la première. Il participe également aux Grands Jours de Poitiers (1579) et de Troyes (1583) : lors de ces assises, qui se tiennent irrégulièrement jusqu’à la fin du xviie siècle, une commission dont les membres sont sélectionnés par le roi au sein du Parlement de Paris est envoyée en province avec tout pouvoir pour entendre et régler les affaires qui lui sont soumises, en particulier celles qui concernent l’abus de droits seigneuriaux. À la faveur de ces événements, Étienne Pasquier rédige et publie les plaisanteries qu’il échange avec ses collègues.

En 1585, il est nommé par Henri III avocat-général du roi à la Chambre des comptes. Il s’y distingue en s’opposant au système de la vente des terres et des charges héréditaires.

Les Guerres de religion le contraignent, en 1588, à quitter Paris pour Tours pendant la Ligue : il met ces années à profit pour travailler sur ses Recherches. En mars 1594, il regagne la capitale avec le convoi d’Henri IV.

Il y reprend son travail avant de prendre sa retraite. Ensuite, il publie en près d’une décennie un grand nombre d’œuvres littéraires, avant de mourir à l’âge de quatre-vingt six ans des suites d’une maladie foudroyante, le 1er septembre 1615.